瞬時轉(zhuǎn)染分析法

1.瞬時轉(zhuǎn)染分析法
目前有很多功能性分析方法用于研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控,zui常用的方法是瞬時轉(zhuǎn)染分析法.該方法是通過一定的轉(zhuǎn)染程序?qū)⒑康恼{(diào)控區(qū)的質(zhì)粒導(dǎo)人培養(yǎng)細(xì)胞.在典型情況下,調(diào)控區(qū)調(diào)控“報告基因”的轉(zhuǎn)錄.報告基因是在mRNA和蛋白質(zhì)的水平上都易于被正確檢測到的基因 .產(chǎn)生的質(zhì)粒在培養(yǎng)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄后,在特定時刻測定從報告基因上合成的mRNA或蛋白質(zhì),以評價調(diào)控區(qū)的活性.人們將這種分析方法稱為瞬時轉(zhuǎn)染分析,因為此時質(zhì)粒仍然以附加的形式存在,很少整合進(jìn)宿主基因組.因此,mRNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物必須在短時間內(nèi)（1～3天）進(jìn)行測定,否則隨著細(xì)胞的生長和分裂,質(zhì)粒會被降解或稀釋.雖然瞬時轉(zhuǎn)染分析法具有多種局限性,但該方法仍然常用于對順式作用DNA序列和調(diào)控基因表達(dá)的反式因子進(jìn)行初步分析.
快捷、簡單,易于對結(jié)果定量,因此成為啟動子功能分析的方法.
也有兩個主要局限性：首先在被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,質(zhì)粒的人工構(gòu)象和拷貝數(shù)可能會導(dǎo)致特異性調(diào)控元件失活或具有特異功能;其次,不能用于檢測那些需誘導(dǎo)或分化時間超過48～72小時時間期限的研究.
2.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染分析法
對在瞬時轉(zhuǎn)染分析中未表現(xiàn)出預(yù)期活性的調(diào)控區(qū),或依賴于特異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)控區(qū),可以采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染分析法,即將含有報告基因的目的基因調(diào)控質(zhì)粒穩(wěn)定地整合進(jìn)基因組.此外,還需將由組成型啟動子控制的抗藥性基因（如顯性選擇標(biāo)記基因）穩(wěn)定地整合進(jìn)基因組進(jìn)行分析.抗藥性基因可以和報告基因在同一個質(zhì)粒上,也可以在不同質(zhì)粒上.將含有報告基因和抗藥性基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞,培養(yǎng)基中加入能殺死不穩(wěn)定表達(dá)抗藥性基因細(xì)胞的藥物,部分質(zhì)粒被穩(wěn)定地整合到染色體上.多數(shù)情況下,在細(xì)胞中多個質(zhì)粒分子彼此相連形成多聯(lián)體,多聯(lián)體隨機整合到多聯(lián)體基因組中,因此每個被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞都具有*的整合位點.然后通過測定被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中報道基因的活性,來確定目的調(diào)控區(qū)的活性.
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染分析方法的主要優(yōu)點是,進(jìn)行分析的調(diào)控區(qū)及報道基因通常位于近乎天然的染色質(zhì)構(gòu)象中,具有近乎天然的拷貝數(shù),這些特點使調(diào)控區(qū)能更地模擬正常功能.在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染分析中,因?qū)D(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行了選擇性擴增,所以克服子瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞吸收DNA少的缺點.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染分析的另一個特點是對隨后的轉(zhuǎn)錄分析沒有時間限制.因此,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對所需時間相對較長的研究非常有用.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染分析的缺點是因為要進(jìn)行藥物篩選和細(xì)胞擴增,因此操作難度較大,需要的時間較長.
3.體外轉(zhuǎn)錄分析法
體外轉(zhuǎn)錄分析法適用于難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、在轉(zhuǎn)染分析中不能產(chǎn)生具有可檢測活性的啟動子或進(jìn)行基因調(diào)控更研究.該分析方法的一個顯著特點是不需要確定有效的轉(zhuǎn)染條件,而且可以在體外反應(yīng)體系中加入抗體,加入或去除某些轉(zhuǎn)錄因子,以評價特定轉(zhuǎn)錄因子的功能.
4.轉(zhuǎn)基因分析法
轉(zhuǎn)基因分析法是將報告基因和目的調(diào)控區(qū)穩(wěn)定地隨機整合到動物基因組中,以檢測天然的前后序列中調(diào)控區(qū)的活性.該分析方法能用于確認(rèn)轉(zhuǎn)染分析中鑒定的特定調(diào)控區(qū)或調(diào)控元件.
5.同源重組分析法
同源重組分析法很少用,僅在培養(yǎng)細(xì)胞或動物基因組中對內(nèi)源基因進(jìn)行操作.