瓊脂糖凝膠電泳制備方法及核酸檢測(cè)

一. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1、掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理;

2、學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳的操作。

二. 實(shí)驗(yàn)原理

瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，沸水中溶解，45℃開(kāi)始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。

DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA，其分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。

溴化乙錠（EB）未扁平狀分子，在紫外照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物，其發(fā)射的熒光強(qiáng)度較游離狀態(tài)EB發(fā)射的熒光強(qiáng)度大10倍以上，且熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比。

三、儀器和試劑

儀器： 微量移液器，電泳儀，電泳槽，微波爐

試劑： 瓊脂糖：1.0%；電泳緩沖液（50 × TAE 電泳緩沖液取Tris24.2g ，冰醋酸5.7ml ， 0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml ，加蒸餾水至100ml ） EB：5 ?l / 100 ml TBE

電泳材料：標(biāo)準(zhǔn)分子量核酸（DL2000）

四. 操作步驟

（1）制膠（以20 mL為例）

a. 稱取0.2 g 瓊脂糖，加入20 ml 的1XTAE緩沖液（pH 8.0），搖勻；

b. 微波爐加熱，至瓊脂糖wan全溶解（要防止過(guò)熱溢出三角瓶）；

c.將制膠板放入制膠槽中，插入適當(dāng)?shù)氖嶙?，將溶解的瓊脂糖（約50℃）加入2ul EB后，混均勻，倒入其中，直至厚度為4～6 mm（如有氣泡要把氣泡趕出），在室溫下冷卻凝固(約30~ 45 min)；

d.小心垂直向上拔出梳子,以保證點(diǎn)樣孔完好,將膠板置于電泳槽中。

（2）點(diǎn)樣

用微量移液器將5 ?l含藍(lán)色染液的 DL2000 加入點(diǎn)樣孔下部。

（3）電泳

打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3~5 V/cm(約100 V)，可見(jiàn)到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動(dòng)，約30-40分鐘后即可觀察結(jié)果。

（4）觀察

將電泳好的膠置于紫外透射檢測(cè)儀上，打開(kāi)紫外燈，可見(jiàn)到橙紅色核酸條帶，根據(jù)條帶粗細(xì)，可粗略估計(jì)該樣品DNA的濃度。如同時(shí)有已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA進(jìn)行電泳，則可通過(guò)線性DNA條帶的相對(duì)位置初步估計(jì)樣品的分子量。

五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

點(diǎn)樣時(shí)效果較好的照片點(diǎn)出的白色熒光線比較亮，條帶粗細(xì)均勻；條帶沒(méi)有出現(xiàn)兩端粗中間細(xì)的情況